WB实验是研究蛋白常用的实验之一,实验流程相对简单,但是碰到的问题也是不少,其中最常见的问题如下:

1、信号太弱

2、背景过高,背景很脏

3、非特异性条带过多

然后你不断优化,加大上样量;提高一抗、二抗浓度,想了很多办法,看了很多网站和论坛,大家说了很多的原因,包括样本不干净,样本有降解,抗体不特异,二抗不纯,封闭液不干净等等。

终于……崩溃了…

怎么办呢?先看看我们是怎么优化的!

奇迹1

样品:K562细胞全细胞裂解液。

(Lane 1: 25μg总蛋白;Lane 2: 5μg总蛋白;Lane 3: 2.5μg总蛋白)

一抗:anti-PKC(Ab-2)小鼠单抗(MC5)(货号OP74),分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(图1图A)和SignalBoost Solution1(图1图B)按照1:1000比例稀释

二抗:Rabbit anti-mouse IgG,分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(图1图A)和SignalBoost Solution 2(图1图B)按照1:10,000比例稀释。

检测:化学发光法(曝光30秒)

结果:

奇迹2

样品:全细胞裂解液

一抗:anti-ERK1的抗体,分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(图2左图)和SignalBoost Solution 1(图2右图)按照1:200比例稀释

二抗:分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(图2左图)和SignalBoost Solution2(图2右图)按照1:3000比例稀释,室温1小时

检测:化学发光法(曝光5分钟)

结果:

奇迹3

一抗:anti-p-PRAK,分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(图3上图)和SignalBoost Solution 1(图3下图)按照1:1000比例稀释。

二抗:用5%脱脂奶粉PBST溶液(图3上图)和SignalBoost Solution 2(图3下图)按照1:2000比例稀释。

结果:参照图3

奇迹4

样品:大鼠脑组织裂解液。

一抗:anti-SERT兔多抗,用2.5%脱脂奶粉PBST溶液(图4图A)按照1:1000比例稀释;用SignalBoost Solution 1(图4图B)按照1:10,000比例稀释。

二抗:anti-rabbit IgG,用2.5%脱脂奶粉PBST溶液(图4图A)按照1:1000比例稀释;用SignalBoost Solution 2(图4图B)按照1:10,000比例稀释。

结果:

实验中反复提到的Signal Boost是什么呢?

Signal Boost是德国默克公司经验丰富的研发团队经过不断摸索,开发的免疫信号增强试剂盒(货号:407207)。是一种用于免疫检测的特殊配方的抗体稀释液,可以促进抗原抗体特异性结合,产生比传统方法高几倍甚至十几倍的信号强度,从而解决免疫检测实验中(比如免疫印迹,ELISA等)经常遇到的低灵敏度和高背景强度等问题,得到准确清晰的实验结果。

试剂盒操作简单方便,含有溶液1和2两种即用型溶液,分别用做一抗和二抗的稀释液,替代其他的传统稀释缓冲液,如TBS,TBST,PBS,PBST等。其余操作均按照标准的免疫检测操作流程进行。此外,试剂盒中各组分对标记抗体的酶活性(辣根过氧化物酶HRP,碱性磷酸酶AP等)均没有影响,可以用于化学发光,比色法,荧光法检测实验。

SignalBoost 免疫信号增强试剂盒有几大优势:

1.显著改善信噪比,提高低丰度蛋白的检测成功率,得到更好的结果;

2.与传统的方法相比,最多可节省90%的抗体用量,大大节约了实验成本;

3.使用方便,操作简单。即用型溶液,不需任何前处理,节省时间和精力;

4.应用面广。可用于WB、ELISA、免疫斑点杂交等检测实验,与化学发光,比色法,荧光法兼容。

SignalBoost简单操作示意图:

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